Nel controllo qualità farmaceutico il saggio più diffuso per il rilevamento delle endotossine batteriche è il LAL Test. Sviluppato negli anni ’70, è rimasto fino a oggi il metodo più efficace e utilizzato. Ma la materia prima alla base della sua produzione sta sollevando non pochi problemi etici oltre che di natura pratica. Il nome esteso del saggio, Limulus Amebocyte Lysate Test, infatti, rende palese che la chiave del suo funzionamento sono i limuli, artropodi marini sempre più rari. Ecco perché si va alla ricerca di alternative sintetiche.
Rivoluzionario LAL Test
Rintracciare le endotossine all’interno dei farmaci iniettabili è un passaggio fondamentale per stabilirne la sicurezza. Questi composti lipopolisaccaridici, componenti strutturali dei batteri Gram negativi, sono infatti tossici per gli esseri umani e, insieme ai pirogeni non-endotossinici, possono causare reazioni avverse anche molto gravi.
Fino agli anni ’70 l’unico metodo esistente per il loro rilevamento era l’RPT Test (Rabbit Pyrogen Test). Sviluppato negli anni ’40, questo saggio prevede l’inoculazione del farmaco in un gruppo di conigli e il monitoraggio della loro temperatura corporea. Oltre a non essere particolarmente sensibile né molto robusto, l’RPT Test necessita di un massiccio impiego di animali da laboratorio. Per questo lo sviluppo di un’alternativa fu accolto con grande interesse.
E l’alternativa era proprio il LAL Test. Sebbene sensibile solo nei confronti delle endotossine e quindi incapace di rilevare i pirogeni nella loro totalità, questo metodo era robusto, estremamente sensibile e più economico dell’RPT Test. La mancanza di necessità di uccidere i limuli per produrlo lo rendeva anche meno crudele del saggio sui conigli. Ben presto è quindi diventato la prima scelta in fatto di ricerca di endotossine.
Lisato di amebociti di limulo
Il funzionamento del LAL Test si basa sul sangue delle quattro specie esistenti di limulo, detto emolinfa. La parte figurata di questo fluido è costituta unicamente da amebociti, cellule alla base del sistema immunitario dell’animale.
In particolare gli amebociti hanno un’innata e fortissima sensibilità nei confronti delle endotossine. A contatto con i lipopolisaccaridi, infatti, queste cellule scatenano una cascata immunitaria che provoca la coagulazione dell’emolinfa e l’espulsione dell’intruso dall’organismo.
Già dalla sua scoperta questa forma di sistema immunitario primitiva e affascinante ha attirato l’attenzione del settore sanitario. Per poterne sfruttare i benefici, però, è necessario procurarsi l’emolinfa del limulo e per farlo bisogna catturare gli animali in natura e sottoporli a un prelievo di sangue. Dopo centrifugazione le cellule sono lisate in acqua distillata per ottenere gli enzimi responsabili del riconoscimento delle endotossine. In questo modo si produce il LAL Test, che rileva la presenza di endotossine attraverso la formazione di un coagulo gelatinoso.
L’impatto sul limulo
Il controllo delle endotossine è obbligatorio per tutti i farmaci iniettabili, per molti dispositivi medici e per i campioni ambientali connessi alla loro fabbricazione. Questo significa produrre una gran quantità di LAL Test e quindi catturare un gran numero di limuli. Il numero di esemplari di limulo americano (Limulus polyphemus) prelevati dalla costa orientale degli Stati Uniti, areale esclusivo della specie insieme alla costa del Messico, è di circa 500 mila all’anno.
Difficilmente il salasso è di per sé mortale per l’animale, sebbene il quantitativo di emolinfa prelevata sia circa un terzo di quella totale circolante. Tuttavia l’operazione è una fonte di stress che, combinata con il tempo passato fuori dall’acqua, può essere pericolosa per l’animale marino. Inoltre i protocolli adottati con le altre specie di limulo potrebbero prevedere meno tutele. Infatti il limulo tridentato (Tachypleus tridentatus), quello dell’Indopacifico (Tachypleus gigas) e quello delle mangrovie (Carcinoscorpius rotundicauda) vivono in un’area che si estende dalle coste dell’India a quelle della Cina, comprendendo l’Indonesia. Tutte zone in cui il concetto di benessere animale fatica a prendere piede.
Le stime più ottimistiche basate sui dati statunitensi parlano del 15% di animali morti in seguito al prelievo, mentre le più pessimistiche si spingono al 30%. Ignota è inoltre l’entità delle conseguenze a carico della fitness riproduttiva degli animali che, una volta reimmessi nell’ambiente, sperimentano diversi effetti negativi non letali e disorientamento. Considerando anche la mancanza di dati provenienti da alcune zone di prelievo, il quadro complessivo è complicato.
rFC: una valida alternativa al LAL Test?
Negli anni la necessità di alternative animal-free al LAL Test si è fatta sempre più concreta e nel 1997 ha portato i suoi primi frutti. In quell’anno, infatti, due scienziati della National University of Singapore riuscirono per la prima volta a clonare il DNA di una delle molecole responsabili del rilevamento delle endotossine negli amebociti di limulo. Basandosi su questo composto, detto Fattore C ricombinante (rFC), riuscirono a sintetizzare il primo saggio alternativo al LAL Test. In questo caso la presenza di endotossine non causa coaguli ma porta al rilascio di un composto fluorogenico.
Benché siano passati quasi 20 anni dall’inizio della sua commercializzazione, avvenuta nel 2003, l’rFC stenta però a sostituire il LAL Test. I dubbi principali riguardano la sua efficacia in confronto al saggio basato sull’emolinfa del limulo. Come ha scritto per American Pharmaceutical Review John Dubczak, direttore dello Sviluppo Reagenti per la divisione Microbial Solutions di Charles River, il LAL Test non contiene solo un enzima. La sua forza risiede infatti nella combinazione di molecole evolute dal limulo nei suoi 450 milioni di anni di permanenza sulla Terra.
Eppure l’efficacia dell’rFC è stata ampiamente dimostrata. Una ricerca californiana pubblicata su Plos Biology, ad esempio, riassume ben 10 studi condotti indipendentemente in Europa e Stati Uniti da università e aziende farmaceutiche che assicurano l’efficacia del test. Tuttavia la mancanza di armonizzazione tra Farmacopee rispetto all’rFC porta alla necessità di validazioni aggiuntive in caso di adozione, oltre a un’inevitabile rinnovo delle competenze e degli strumenti in gioco rispetto a quelli necessari per il LAL Test. Inoltre la tendenza a continuare a percorrere la strada battuta piuttosto che innovare è ben radicata nel settore farmaceutico, soprattutto quando si parla di analisi che hanno a che fare con la sicurezza del prodotto.
Quale futuro?
L’rFC sostituirà il LAL Test? Molto dipende dalle scelte delle aziende, ma anche delle autorità regolatorie. La tendenza è infatti sempre più spesso quella di eliminare i test che coinvolgono animali, quando possibile. Lo sviluppo di tecniche alternative per rilevare i pirogeni non endotossinici ad esempio ha portato nel 2021 l’EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines&HealthCare) a decidere di intraprendere un processo che nell’arco di 5 anni porterà alla completa eliminazione dell’RPT Test dalla Farmacopea Europea.
Il passaggio dal LAL Test all’rFC si renderà inoltre sempre più indispensabile mano a mano che le popolazioni di limuli diminuiranno. Le due specie di cui sono disponibili dati vengono infatti classificate dalla IUCN come in pericolo e vulnerabile. E le loro popolazioni sono in diminuzione. Questo rappresenta innanzitutto un danno ecologico, visto il ruolo chiave dei limuli per il benessere degli ecosistemi in cui vivono. Numerose specie uccelli marini e animali acquatici sono infatti strettamente connesse al ciclo vitale dell’animale.
Ma rappresenta un problema anche per la produzione su larga scala del LAL Test stesso. Il ritmo con cui i limuli vengono prelevati dall’ambiente per tenere il passo con le richieste del mercato è infatti insostenibile. Non resterà che passare all’rFC? La recente scadenza del brevetto ha abbattuto una delle barriere che ostacolavano l’adozione del saggio. Le aziende infatti sono spesso riluttanti nell’affidarsi a un unico fornitore, soprattutto per passaggi importanti come il test delle endotossine. Resta da capire se sarà possibile abbattere anche le altre barriere.
