Per lungo tempo non si è potuto parlare di sperimentazione modello in quanto le sperimentazioni di prodotti a uso umano sono state sempre svolte su animali: dalle prove tossicologiche di base fino ai test su farmaci, cosmetici, prodotti chimici. Con il cambiare della sensibilità comune e con il crescente rispetto riservato agli animali, compresi quelli da laboratorio, si sono cercate soluzioni diverse.
In ambito cosmetico la legislazione prevede dal 2013 il divieto di usare animali e ci si affida ai modelli alternativi (ormai non più alternativi, in quanto attuale modalità standard): per prodotti finiti e ingredienti sperimentati su animali c’è il bando dal mercato.
Anche il Reach e altre normative di riferimento per il settore chimico, pur richiedendo dati che evidenzino il grado di tossicità per l’uomo e per l’ambiente delle sostanze commercializzate in UE, obbligano gli attori del mercato, perfino concorrenti tra loro, a condividere i dati esistenti per evitare sperimentazioni ridondanti, e invitano al ricorso preferenziale a metodi in vitro, in silico e al read across. Il motore di questo cambiamento è l’Unione europea.
Per quanto riguarda la protezione degli animali utilizzati ai fini scientifici, l’UE ha emesso la Direttiva 63/2010, che va nella direzione di limitare la sperimentazione animale ai soli casi in cui è realmente necessaria. L’Italia ha recepito tale direttiva con il D.L. 26 del 4 marzo 2014, che stabilisce le procedure per l’utilizzo di animali a fini scientifici ed educativi (per esempio esercitazioni in scuole o università).
Nella ricerca biomedica e farmacologica la ricerca su animali è ancora possibile. Tuttavia, quando questo avviene, la legge stessa definisce alcuni diritti basilari degli animali da tenere in considerazione.
La normativa afferma inoltre che tutti i progetti di ricerca che prevedono l’uso di animali debbano essere preventivamente visionati e approvati dall’Organismo preposto al benessere degli animali (Opba), che a sua volta inoltra la domanda di autorizzazione al ministero della Salute tramite la “Banca dati telematica della sperimentazione animale”. Tutti i progetti di ricerca con l’impiego di animali vertebrati e taluni invertebrati (come i cefalopodi) devono infatti essere autorizzati dal ministero.
Esiste inoltre un Comitato nazionale per la protezione degli animali usati a fini scientifici, istituito con il decreto ministeriale 24 febbraio 2016 (sempre ai sensi D.L. 26/2014) presso la Direzione generale della sanità animale e dei farmaci veterinari del ministero della Salute; la sua composizione è stata rinnovata con DM del 1 giugno 2021.
Il compito principale di questo comitato è di fornire consulenza alle autorità competenti e agli Opba su tutte le questioni relative al D.L. stesso e in particolare sulla tutela del benessere degli animali, nonché su quanto è relativo all’acquisizione, all’allevamento, alla sistemazione, alla cura e all’uso degli animali, assicurando la condivisione delle migliori pratiche. Il comitato espleta numerose attività e funzioni, tra cui quella di promuovere il principio delle 3R.
3R
Refinement, reduction, replacement: il principio delle 3R è stato proposto per la prima volta più di 60 anni orsono dai biologi britannici Russel e Burch nel libro “The principles of humane experimental technique” (1959), risultato di un progetto guidato dalla Universities federation for animal welfare (Ufaw), supervisionata da un comitato che includeva il futuro premio Nobel Peter Medawar.
Le alternative di sostituzione (replacement) si riferiscono a metodi che evitano l’uso di animali, o lo sostituiscono. Questo include sia le sostituzioni assolute (cioè la sostituzione degli animali con modelli computerizzati) sia le sostituzioni relative (cioè la sostituzione dei vertebrati con animali che hanno un’inferiore percezione potenziale del dolore, come alcuni invertebrati).
Le alternative di riduzione (reduction) si riferiscono a qualsiasi strategia che comporti l’utilizzo di un minor numero di animali, ottenendo comunque dati sufficienti per rispondere alla domanda di ricerca, o la massimizzazione delle informazioni ottenute per animale e possa quindi potenzialmente limitare o evitare il successivo utilizzo di animali aggiuntivi, senza tuttavia compromettere il benessere degli animali.
Le alternative di raffinamento (refinement) si riferiscono alla modifica delle procedure di allevamento o di sperimentazione per ridurre al minimo il dolore e l’angoscia e per migliorare il benessere di un animale utilizzato nella scienza dal momento della sua nascita fino alla sua morte.
Anche l’industria farmaceutica aderisce da tempo a questo punto di vista. Efpia (European federation of pharmaceutical industries associations) già nel 2019 ha diffuso il report “Putting animal welfare principles and 3rs into action”, in cui si mettono in evidenza esempi di buone pratiche finalizzate al miglioramento della qualità di vita degli animali utilizzati a scopo di ricerca.
Il report invita inoltre gli associati a promuovere la cultura delle 3R nonché a evitare o limitare quanto più possibile il ricorso alla sperimentazione su animali, con lo scopo di aderire a un totale cambio di paradigma nell’approccio alla sperimentazione, andando perfino oltre la richiesta normativa.
Per esempio mettendo in atto pratiche routinarie che pongano l’attenzione sulle elementari norme per il benessere degli animali in base all’etologia delle diverse specie. Oppure sviluppando dispositivi meno invasivi o ricorrendo a metodi alternativi che in molti campi hanno ormai ottenuto la validazione per gli scopi di ricerca.
Oltre le 3R
La ricerca in vitro non pone sostanzialmente problemi agli occhi del pubblico, è relativamente poco costosa ed è suscettibile di cicli iterativi di tentativi ed errori utilizzando disegni di studio statisticamente molto solidi. Pertanto con i sistemi in vitro esiste un’opportunità intrinseca di condurre ricerche esplorative ad ampio raggio.
Viceversa, la sperimentazione in vivo è più costosa e una buona percentuale di popolazione è fermamente contraria (soprattutto su animali superiori come i vertebrati). Le considerazioni sono sia etiche che finanziarie. In molti Paesi ormai la legge afferma che un esperimento sugli animali non dovrebbe essere eseguito se è disponibile un metodo alternativo, e alcuni Paesi vietano apertamente la sperimentazione su determinati animali, come le scimmie antropomorfe, con una crescente pressione per estendere i divieti agli animali di specie cosiddette inferiori.
L’utilizzo di animali da laboratorio nella ricerca è dunque poco agile e molto costoso, e pone problemi di “consenso”. Considerando una sempre crescente richiesta di prove tossicologiche da parte del legislatore (per andare a formare il dossier del prodotto che sarà messo in commercio), e considerando anche che la ricerca biomedica è sempre più orientata alla medicina di precisione e alle terapie biologiche, arriva di conseguenza una spinta da più direzioni verso la sostituzione completa dei test su animali, cercando al tempo stesso metodologie più aderenti allo specifico della fisiologia umana.
Il principio delle 3R è stato (ed è tuttora) una pietra miliare di questo percorso, ma si parla ormai superarlo e fare un ulteriore passo avanti. I metodi di ricerca senza modelli animali rappresentano la cosiddetta sperimentazione modello e una notevole opportunità di crescita per la ricerca stessa: le tecnologie in uso sono all’avanguardia e i finanziamenti a supporto dei progetti di studio sono rilevanti, provenienti sia dall’Unione Europea sia da diversi comparti industriali.
Mediante propri programmi quadro sulla ricerca, come quelli denominati Horizon, l’EU ha creato un tessuto favorevole alla messa a punto di strategie alternative con EURL Ecvam (European union reference laboratory for alternatives to animal testing), un centro di coordinamento per gli studi di metodi animal free. Il fine è quello di integrare le conoscenze di biologia cellulare con le “omics technologies” per ottenere modelli adeguati a definire l’effetto sulla salute umana in seguito all’esposizione a una sostanza potenzialmente dannosa.
EURL ha coordinato centri di ricerca europei su temi quali la tossicità delle miscele chimiche, gli interferenti endocrini, la valutazione della tossicità acuta delle sostanze, il bio-accumulo dei prodotti chimici negli organismi acquatici e terrestri e altri temi di tossicità ambientale.
Ma i test alternativi sono una risorsa fondamentale anche nell’ambito della ricerca biomedica. EURL Ecvam già da anni indaga ed esamina gli approcci che prescindono dalla sperimentazione animale in svariati ambiti specifici: dai test immunogenici per terapie avanzate alle malattie cardiovascolari, dalle malattie autoimmuni ai problemi respiratori, dal tumore al seno ai modelli immuno-oncologici.
EURL Ecvam è inoltre attivo in ambito regolatorio e si occupa della validazione di nuovi test, anche con attività di peer review, e con il coinvolgimento preliminare delle autorità regolatorie quando si tratta di validare nuovi metodi.
Anche la Food and drug administration (Fda) statunitense ha dimostrato il suo impegno ad approfondire lo sviluppo di approcci complementari o alternativi ai modelli animali quando ha annunciato nel dicembre 2020 l’Innovative science and technology approaches for new drugs (Istand).
Il programma pilota mirava a velocizzare la qualificazione e l’uso di nuovi strumenti di sviluppo di farmaci. L’annuncio include esplicitamente l’uso di chip tissutali e sistemi microfisiologici per valutare questioni di sicurezza o efficacia, lo sviluppo di nuovi saggi farmacologici e tossicologici non clinici, fino all’uso di algoritmi basati su AI per valutare i pazienti, sviluppare nuovi end-point o come base per la progettazione di uno studio.
Modelli di Covid
Lo sviluppo di terapie contro le malattie infettive (e la loro prevenzione) dipende dalla disponibilità di modelli di malattia. Per restare nella stretta attualità, la risposta della comunità medica al Covid-19 dipende molto dalle possibilità di modellizzazione, sia nel tradizionale modo che utilizza modelli animali sia utilizzando i NAM (vedi box).
Quando è iniziata la pandemia non è stato possibile stabilire alcun modello animale “buono” di Covid-19 e tale modello manca ancora oggi. E se anche se venisse identificato un modello animale adatto, occorre considerare che gli esiti dell’infezione virale possono variare drasticamente perfino all’interno di animali della stessa specie.
La bioingegneria degli organoidi umani e degli organi su chip si è mostrata in questo campo una strada di ricerca estremamente promettente.
Organoidi sono stati usati per studiare il coinvolgimento del sistema nervoso umano nel Covid-19. Prima degli studi su organoidi cerebrali, non c’erano evidenze in modelli animali che il Covid-19 potesse interessare il sistema nervoso. In particolare, i sistemi di organi in miniatura coltivati in laboratorio sono stati ampiamente utilizzati durante la pandemia per mostrare i numerosi effetti dell’agente eziologico (il coronavirus respiratorio acuto severo 2, SARS-CoV-2) sugli organi umani. L’esposizione al virus della maggior parte degli animali non ha provocato infezioni, o ha causato solo lievi segni clinici, non il grave decorso dell’infezione sofferto da molti esseri umani.
I sistemi microfisiologici hanno dunque fornito una grande opportunità per studiare Covid-19 in vitro, in particolare riguardo all’infezione delle cellule cerebrali e alla sua rilevanza per gli effetti di Covid-19 sul cervello umano.
La neurovirulenza di SARS-CoV-2 è stata riprodotta in diversi tipi di organoidi basati su cellule cerebrali umane, mostrando costantemente l’infezione di una piccola porzione di cellule cerebrali accompagnata da una replicazione virale limitata. Ciò rispecchia le manifestazioni neurologiche sempre più riconosciute nei pazienti con Covid-19 (infezione da virus e formazione di anticorpi specifici del cervello nel tessuto cerebrale e nel liquido cerebrospinale).
